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?为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10μ

文章出处:哥本哈根赌场 人气:发表时间:2020-06-25 04:24

  高效液相色谱 high performance liquid chromatograph, HPLC Agilent 1100 第一节 高效液相色谱法的原理 一、高效液相色谱法的特点 气相色谱法:较易挥发、且热稳定的有机化 合物。~20% 液相色谱法:用气相色谱法难以分析的物质, 如难挥发、热不稳定、分子量大、具有生物 活性的物质。~80% ? 高效液相色谱法与经典液相色谱法 例:分离20种氨基酸 经典柱色 谱 经典液相 色谱法 高效液相色谱仪 经典液相色谱 HPLC 固定相粒径 150-200 μm 3-10 μm 流动相驱动方式 重力或低压泵 高压泵 流动相流速 很慢 快(1-10mL/min) 柱长:170 cm 柱径:0. 9 cm F:30 mL/h t : 20 h HPL C t :1 h 高压、高效、高速 二、高效液相色谱法的分类 1、按分离原理分类 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 2、按极性分类 正相色谱 反相色谱 1、按分离原理分类 1)吸附色谱(液-固) 固定相:固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等,较常 使用的是5~10μm的硅胶吸附剂; 流动相:各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理:组分在固定相上的吸附与解吸。 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样。 2)分配色谱(液-液) 固定相与流动相均为液体(互不相溶); 基本原理:组分在固定相和流动相上的分配; 固定相:由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体 表面涂渍固定液,固定液易流失,较少采用; 化学键合固定相:将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶(担体)表面。C-18柱: 3)离子交换色谱 固定相:阴离子离子交换树脂 或阳离子离子交换树脂; 流动相:酸性或碱性水溶液; 基本原理:利用不同离子对树脂的 离子交换能力不同来实现分离。 应用:离子及可离解的化合物, 氨基酸、核酸等。 4)排阻色谱(又称凝胶色谱) 固定相:凝胶(具有一定大小孔隙分布); 原理:按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙,由 其中通过,出峰最慢;中等分子 只能通过部分凝胶空隙,中速通 过;而大分子被排斥在外,出峰 最快。 可对相对分子质量在100-105 范围内的化合物按质量分离。 2、按极性分类: 1) 正相色谱: 是由极性固定相和非极性(或弱极性)流动 相所组成的色谱体系。其代表性的固定相是改性硅 胶、氰基柱等,代表性的流动相是正己烷。 2) 反相色谱: 由非极性固定相和极性流动相所组成的色谱 体系,与正相色谱体系正好相反。其代表性的固定 相是十八烷基键合硅胶(ODS柱),代表性的流动相 是甲醇和乙腈。是当今HPLC最主要的分离模式。 第二节 高效液相色谱仪的组成 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 一、输液系统 高压输液泵 脱气装置 梯度淋洗系统 1、高压输液泵 ?主要部件之一,压力:150~350×105 Pa。 ?为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10μm),液 体的流动相高速通过时,将产生很高的压力,因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min ?应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性 2、脱气装置 用于脱去流动相中的溶解气体,流动相先经过脱 气装置再输送到色谱柱。 脱气机、超声脱气、线、梯度淋洗装置 等度洗脱 输液泵 进样器 柱温箱 色谱柱 检测器 单一或混合溶剂 等度洗脱 MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长 分离度差 MeOH / H2O = 8 / 2 怎样解决呢? 梯度洗脱 A A泵 进样器 色谱柱 柱温箱 B 浓度 B B泵 时间 检测器 MeO H 梯度洗脱 95% 30% 优点:可提高分离度、缩短分离时间、 降低最小检测量和提高分离精度。 二、进样系统 流路中为高压力工作状态, 通常使用耐高压的六通阀进样装置: 三、分离系统 色谱柱: C18色谱柱 SIL XDB-C8 填料: 十八烷基硅基化学键合 到多孔硅胶或陶瓷微粒 多孔硅胶微粒 辛基硅烷化学键合到 多孔硅胶微粒上 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相。 a. 硅氧碳键型: ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型:≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型: ≡Si—C d. 硅氮键型: ≡Si—N 四、检测系统 1、紫外检测器 应用最广,对大部分有机化合物有响应。 UV 灯 滤光片 采样二极管 光栅 狭缝 镜1 样品池 镜2 参考二极管 2、光电二极管阵列检测器 DAD 紫外检测器的重要进展; 光电二极管阵列检测器:1024个二极管阵列,各检测特 定波长,计算机快速处理,三维立体谱图。 3、荧光检测器 高灵敏度、高选择性; 对 多 环 芳 烃 、 维 生 素 B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应。 4、质谱检测器 第三节 高效液相色谱法的应用 一、定性分析 (1) 保留值定性 (2) 相对保留值定性 (3) 与其他仪器联用 标准品:A-甲醇;B-乙醇;C-正丙醇; D-正丁醇;E-正戊醇 二、定量分析方法: 1、校正因子定量: 组分的峰面积越大, 在样品中所占比例越大? W = f A W = f A ? ? ci i% ? mi m1 ?i m2 ?ii ? ? mn ?100% ? ii Ai n ? 100% Ai i?1 fi 称为校正因子。 fi =0? 同一检测器,对不同组分的敏感度不同。 校正因子fi 分为绝对和相对校正因子两种。 绝对校正因子: fi ? Wi Ai 由于受到仪器及操作条件的影响程度很大, 实际定量分析时,基本上不使用。 相对校正因子 fi? : 某物质 i 与一选择的标准物 质 S 的 绝对

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